«اطلاعات اين سايت، قديمی و غيرقابل استناد بوده و صرفا به عنوان آرشيو نگهداری می‌شود.»
   [صفحه اصلی ]   [ English ]  
:: مشاهده مقالات ::
:: - ۱۳۸۵/۱۰/۲۰ - جلد:۱۰ - شماره:۲ - 2007/01/10 - Volume:۱۰ - Number:۲ ::
زبان مقاله منتشر شده
عنوان انگلیسی Designing of relative quantitative real-time PCR for detection of CD40 gene expression in dendritic cell after suppression with antisense
عنوان فارسی طراحی روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمی نسبی برای بررسی بیان
عنوان مختصر
کد مقاله (doi)
موضوعات مقاله منتشر شده
نوع مقاله منتشر شده
چکیده انگلیسی مقاله Objective: Dendritic cells have a critical role in control and regulation of immune responses. It is believed that these cells can be used for the treatment of many diseases. One of the methods used in immunotherapy is based on generating of tolerogenic dendritic cells through inhibition of expression costimulatory molecules. CD40 is one of the costimulatory molecules, and inhibition of expression by antisense or siRNA techniques, can generate tolerogenic dendritic cells. Generation of tolerogenic dendritic cells will be useful in the treatment of many diseases. By developing a quantitive RT-PCR for evaluation of gene expression, generation of these cells could be possible. Using proper software we designed an Antisense and transfection of dendritic cells by lipofectamine 2000 (Invitrogen) could lead us to generate tolerogenic dendritic cells. Materials and Methods: In this study dendritic cells were extracted from of Balb/c mice Spleen and the purity of this extraction was determined by flow cytometry.BCL1 cell line as a CD40 expressing control group and Wehi-164 cell line were cultured in RPMI-1640+10%FCS. Primer design for CD40 gene and house keeping gene (GADPH) was done by bioinformatic soft wares such as Beacon designer, mfold and Blast. RNasy plus mini kit (Qiagen) was used for RNA extraction and the Purity and integrity were determined by O.D at 260/280 and agarose gel electrophoresis. In the next step cDNA synthesized and quantitative RT-PCR for CD40 using IQ sybergreen (Biorad) were setup. Finally, standard curve for CD40 and internal control in different RNA concentrations were performed. After transfection with lipofectamin 2000 the amount of gene suppression were quantified by qualitative RT-PCR. Results: Using gradient real time PCR, optimum annealing temperature, Ct and ∆Rn for CD40 and GADPH were determined, annealing temperature was 59.5ºc and melting temperature was 84°c. Slope of the curve and the efficacy of PCR for CD40 and GADPH genes were quantified by serial dilution method. CD40 Standard curve efficiency is 96.5 and the slope is -3.408 and the efficacy of GADPH standard curve is 94.1 and its slope is -3.471. The amount of CD40 gene suppression by antisense in dendritic cells was 1/32 and in BCL1 cell line was 1/64. Also the transfection reagent had no effect on the gene expression. The best time for CD40 gene expression is 48 h after transfection. Conclusion: Semi quantitative PCR, absolute quantitative PCR and relative quantitative PCR are used to evaluative the expression of different genes such as CD40. In this study we found that for making CD40 and GADPH standard curves, Biorad two steps PCR kit (IQ-sybergreen) and Oligo dt for cDNA synthesis were very suitable. In this case, GADPH is a good internal control. Also for evaluation of gene suppression relative quantitative RT-PCR was more efficient compare to other methods such as northern blotting. The CD40 gene Suppression after 48 hours in dendritic cells was 1/32 and in BCL1 cells was 1/64.
چکیده فارسی مقاله هدف: سلول‌های دندریتیک در تنظیم وکنترل پاسخ‌های ایمنی نقش مهمی به عهده دارند. امروزه نظر بر این است که از این سلول‌ها در درمان بسیاری از بیماری‌ها می‌توان استفاده کرد. یکی از راه‌های ایمونوتراپی ایجاد سلول‌های دندریتیک تولروژن از طریق ممانعت از بیان مولکول‌های کمک تحریکی است.CD40 یکی از مولکول‌های کمک تحریکی بوده که با ممانعت از بیان آن از طریق روش‌هایی مانند آنتی‌سنس و یا SiRNA می‌توان به این مهم (سلول‌های دندریتیک تولروژن) دست پیدا کرد. با تولید سلول‌های دندریتیکی تولروژن می‌توان افقی روشن در درمان بسیاری از بیماری‌ها ایجاد نمود و با طراحی RT-PCR کمی برای اندازه‌گیری میزان بیان می‌توان راه را برای ایجاد این سلول‌ها هموار نمود. در این تحقیق با طراحی آنتی‌سنس با استفاده از نرم‌افزارهای مربوط و منتقل کردن آن به سلول‌های دندریتیکی با استفاده از ماده ”لیپوفکتامین 2000“ (Invitrogen) به سلول دندریتیک تولروژن رسیده‌ایم. مواد و روش‌ها: در این مــطالعه سـلول‌های دندریتیک از طحال موش Balb/c جـدا شد و مــیزان خلوص به وسـیله فـلوسیتومتری بر اساس نشانگر CD11Cتعیین شد. رده سلولیBCL1 به عــنوان گـروه کنترل، بیان‌کننده CD40 در مـحیط کـشت FCS 10% RPMI-1640+ کـشت داده شـدند. با اســتفاده نـرم‌افــزارهای بیوانفورمــاتیک Beacon Designer و mfold and Blast آغــازگر برای ) GADPHبه عـنوان کـنترل داخـلی) و CD 40 طراحی شد، کیت RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) برای استخراج RNA مورد استفاده قرار گرفت و با تعیین O.D280/260 و الکترفورز در آگارز مـیزان خلوص تعیین شد. در ادامه کار ابتدا PCR کیفی با استفاده از آنزیم Fast Hot Start Taq (Roche) بهینه شد و سپس بعد از ساخت cDNA با استفاده از کیت IQ sybergreen (Biorad)،RT-PCR کمی برای CD40 بهینه و در نهایت با استفاده از همین کیت منحنی استاندارد پس از تهیه رقت‌های مناسب از RNA برای CD40 و کنترل داخلی محاسبه شد. پس از طراحی آنتی‌سنس با استفاده از نرم‌افزار‌های بیوانفورماتیک با استفاده از ماده ”لیپوفکتامین 2000“ انتقال، انجام و با استفاده از RT-PCR کمی میزان کاهش بیان ژن مشخص شد. نتایج: دمای بهینه اتصال با استفاده ازشیب Real time PCR و بهترین CT و Rn∆ در 5/95 درجه سانتی‌گراد برای هر دو ژن CD40 و GADPH تعیین و همچنین دمای ذوب PCR حدود 84 درجه سانتی‌گراد مشخص شد. شیب و بازدهی واکنش PCR برای ژن‌های CD40 و GADPH با روش رقت سریال تعیین شد. با استفاده از غلظت نابرابر آغازگرها بازدهی و شیب برابری این دو ژن با دمای اتصال یکسان تعیین شد. (بازده CD40: 5/96، شیب: 408/3- ؛ بازده GADPH: 1/94، شیب: 471/3-) میزان کاهش بیان ژن پس از انتقال با آنتی‌سنس 64/1در سلول‌های دندریتیکی و در رده سلولی BCL132/1 تعیین شد. ماده منتقل شده تأثیری روی بیان ژن ندارد. بهترین زمان برای اندازه‌گیری کاهش بیان ژن CD40 48 ساعت پس از انتقال در سلول‌های دندریتیکی و رده سلولی BCL1 است. نتیجه‌گیری: در مطالعات مختلف از روش‌های متفاوتی مانند RT-PCR نیمه کمی RT-PCR کمی مطلق و RT-PCR کمی نسبی برای تعیین میزان بیان ژن‌های مختلف ازجمله CD40 استفاده شده است. بررسی‌ها در این تحقیق نشان داد که استفاده از کیت IQ–sybergreen (Biorad) و الیگومر دی‌اکسی تیمیدین برای سنتز cDNA برای رسم منحنی استاندارد ژن CD40 بسیار مناسب است (در این مورد GADPH کنترل داخلی مناسبی است) که در مقایسه با RT-PCR نیمه کمی دقیق‌تر و قابل اعتمادتر است.
کلیدواژه‌های انگلیسی مقاله Dendritic cells, CD40, Real Time PCR
کلیدواژه‌های فارسی مقاله سلول‌های دندریتیک،CD40،Real Time PCR
صفحه آغاز مقاله در نشریه ۲۳
صفحه پایان مقاله در نشریه ۳۳
نشانی اینترنتی
نویسندگان مقاله 93168---93169---93170---93171---93172---93173---93174---
برای برگشت به بخش مقاله‌های منتشر شده اینجا را کلیک كنید.

Health and Biomedical Information System - SEMAT

کلیه حقوق این پایگاه متعلق به معاونت تحقیقات فنآوری وزارت بهداشت،درمان و آموزش پزشکی میباشد.


«اطلاعات اين سايت، قديمی و غيرقابل استناد بوده و صرفا به عنوان آرشيو نگهداری می‌شود.»


Persian site map - English site map - Created in 0.08 seconds with 21 queries by YEKTAWEB 3921